Mùa đông năm 1621, Mạc Kính Khoan ở Cao Bằng lại đem quân quấy phá các hạt xung quanh. Trịnh Tùng được tin, sai Thái úy Vinh quốc công đem quân thẳng tiến đánh lớn với quân nhà Mạc. Quân Mạc thua to, tan chạy về Cao Bằng. Quân Lê - Trịnh đuổi theo tới nơi nhưng không bắt được Kính Khoan, lại phải dẫn quân về[94].

Tháng 5 năm 1623, triều đình tổ chức khoa thi Đình. Bấy giờ người làng Nguyệt Viên, huyện Hoằng Hoá là Nguyễn Trật ngầm mượn người làm bài, việc phát giác. Bình An vương không bằng lòng, cho nên khoa ấy không cho treo bảng vàng.

Tháng 7 năm đó, Trịnh Tùng bị bệnh kiết lị rất nặng, nằm ngồi không yên, bỏ cả ăn uống, thân thể suy nhược, chân tay không nhấc lên được. Ông sai mời các lương y, thầy phép, tăng nhân, đạo sĩ khắp nơi trong nước về bốc thuốc chữa trị, lập đàn cầu cúng, nhưng bệnh tình vẫn ngày càng trầm trọng, thuốc men đều không khỏi. Vương rất lo buồn nhưng chỉ yên lặng ứa nước mắt mà thôi[94].

Bèn cùng các quan văn võ mưu tính chọn thế tử. Vì con trưởng của Chúa là Tín Lễ công Trịnh Túc mất sớm, nên Vương tử thứ 2 là Trịnh Tráng được phong làm Thanh quận công, đảm nhận chính vụ trong phủ đã lâu, coi như đã nắm chắc ngôi Thế tử. Điều này khiến Vương tử thứ 3 là Trịnh Xuân không phục, nên trước kia Xuân đã cùng mưu với vua Lê để hãm hại chúa nhưng không thành[95]. Trịnh Tùng tuy đã giết vua nhưng lại tha tội cho Xuân.

Ngày 14 tháng 7, theo đề nghị của các quan, cho con trưởng Thanh quận công Tráng giữ binh quyền, Vạn quận công Xuân làm phó giữ binh quyền. Trịnh Xuân không chịu và tiến hành nổi loạn.[88] Ngày 15 tháng 7, Xuân cùng quận Biện đem quân vào phủ. Quân túc vệ kinh hãi chạy tan. Trịnh Tùng thấy quân vào, thì trỗi dậy, dùng kim thương mà đâm bừa. Quân lính không dám đến gần, lại vào kho vải, lấy vải vứt đầy trước mặt Trịnh Tùng, rồi đặt ông lên võng đưa ra ngoài cửa phủ. Trịnh Tùng trông thấy Xuân giận quát mắng

Mày sao nỡ làm thế, đạo làm con để đâu?.

Trịnh Xuân kinh sợ, rút quân ra ngoài thành, cướp lấy voi, ngựa, của báu, rồi nhân đó vung lửa đốt. Đô thành đại loạn. Còn Trịnh Tráng nghe có loạn, không biết tin tức về cha mình, bèn sai em là Trịnh Giai rước nhà vua về Ninh Giang, còn mình tự lưu lại ở Nhân Mục, hội họp các quan văn võ cùng bọn Nguyễn Văn Giai bàn bạc việc quân. Về phía Chúa, hầu hạ và bảo vệ ở bên cạnh chỉ có quận Nhạc Bùi Sĩ Lâm, Văn Thuỵ hầu Phùng Văn Minh, cùng Đường Thọ hầu. Trịnh Tùng bảo bọn Sĩ Lâm đưa mình ra khỏi kinh sư đóng ở xứ Quán Bạc phường Hồng Mai, huyện Thanh Trì[96]. Rồi sai Sĩ Lâm đưa mình về dinh của người em là Trịnh Đỗ[Ghi chú 29]. Đỗ sai cơm nước hầu hạ và cho con là quận Thạc đến rước thế tử; nhưng thế tử nghi ngờ quận Thạc có ý khác nên không đi.[97]

Đỗ sai quận Thạc đến chỗ Xuân nói dối là muốn trao binh quyền. Xuân hí hửng cùng mấy chục người vào yết kiến, miệng ngậm cỏ phủ phục ở sân. Đỗ sai dũng sĩ bắt lấy. Trịnh Tùng gượng bệnh ngồi dậy, kể tội nhưng chưa giết và sai giam cùm lại để đợi giao cho luận tội. Trịnh Đỗ sai Sĩ Lâm chặt chân của Xuân cho đến chết.[90] Trịnh Tùng thấy Xuân chết, trong lòng xúc động. Ngày 16 tháng 7, buổi sớm, ông được Sĩ Lâm cùng 60 quân hộ vệ còn lại hộ tống đón thế tử; đến chùa Thanh Xuân, huyện Thanh Oai thì Chúa mất, thọ 74 tuổi. Trịnh Tráng nối ngôi, tức là Văn Tổ Nghị vương.[97]

Theo Nam triều công nghiệp diễn chí của Nguyễn Khoa Chiêm, thì ngày cuối cùng của Trịnh Tùng thê thảm hơn nhiều: ông chỉ nằm vật vờ trên giường không thể nói chuyện được, và tất cả mọi âm mưu, kể cả việc giết Trịnh Xuân, đều do cha con Trịnh Đỗ chủ mưu. Trịnh Đỗ còn có ý dụ tất cả các vương tử vào nhà của mình rồi giết cả đi, để chiếm ngôi Chúa. Nhưng Trịnh Tráng đoán biết được âm mưu đó, nên việc không thành. Về sau Trịnh Tráng dời vua Lê Thần Tông ra Thanh Hoa, còn Chúa đang nằm hấp hối thì bị đưa ra khỏi cung điện, rồi chết dọc đường. Cha con Trịnh Đỗ bỏ xác ông lại trên cầu, may nhờ có viên hoạn quan là thái bảo Nhạc quận công đem thi hài của ông xuống thuyền, chuyển đến chỗ Trịnh Tráng, khi đó mới làm lễ phát tang. Cha con Trịnh Đỗ sau đó lại xin quy phục Trịnh Tráng và được giữ nguyên các chức tước, không bị truy tội gì cả[98].

Giáo sĩ Tây phương Alexandre de Rhodes thuật lại về sự biến động năm 1623[99]

Cho tới ngày tuổi đã quá cao và bị bệnh rối mất, thì người con cả nóng lòng không chờ cho cha khuất đi, đã lọt vào guồng máy cai trị và phạm mấy vụ bạo lực do tính ngạo mạn xấc láo. Người cha hay tin thì khá buồn bực và dự tính không để cho đứa con đó chết yên ổn, liền cho lệnh phải thi hành ngay, nghĩa là cho cắt gân hai vế đùi để cho chết. Đứa con ham quyền này mất đi chỉ vì vội vả hấp tấp, thì người em, khi anh mất, cha băng lên ngôi thế vị cha...

Mộ chúa Trịnh Tùng nay tọa lạc tại làng Sáo Sơn, xã Vĩnh Hùng, huyện Vĩnh Lộc, tỉnh Thanh Hoá.